本發明公開了一種大瀧六線魚卵黃原蛋白夾心ELISA試劑盒、制備方法、檢測方法及應用。本發明通過硫酸銨沉淀與Sephadex G?200從17?雌二醇誘導的大瀧六線魚血漿中純化出卵黃原蛋白，制備多克隆抗體，并將辣根過氧化物酶標記到純化的抗體上；將大瀧六線魚卵黃原蛋白純品、兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體、空白96孔酶標板、以及包被液、洗滌液、封閉液、樣品稀釋液、顯色液、終止液各1支共同裝入盒體，得到檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的夾心ELISA試劑盒。本發明的試劑盒能夠靈敏、準確的定量檢測大瀧六線魚血漿、體表粘液、肝臟組織及肝細胞培養液中的卵黃原蛋白，檢測范圍為1.95～125 ng mL，為我國近岸海域內分泌干擾物的檢測提供了重要工具。

1.一種檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的夾心ELISA試劑盒，包括一個盒體，盒體內有空白
96孔酶標板1塊，封閉液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液各1支，其特征在于該
盒體還裝有：大瀧六線魚卵黃原蛋白純品1支，兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體1支、
辣根過氧化物酶標記的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體1支；
所述的包被液為50mM pH 9.6碳酸鹽緩沖液；
洗滌液為含質量分數是0.05% Tween-20的150mM pH7.4的磷酸鹽緩沖液；
封閉液為含質量分數是2% BSA的pH7.4的磷酸鹽緩沖液；
樣品稀釋液為含質量分數是0.05% Tween-20、1% BSA的150mM 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4；
顯色液為TMB單組分顯色液；
終止劑為2 M H₂SO₄水溶液；
所述的檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的夾心ELISA試劑盒的制備方法，步驟如下：
1)制備大瀧六線魚卵黃原蛋白純品；
2)利用步驟1）得到的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品制備兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多
克隆抗體；
3)利用步驟2)制得的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體制備辣根過氧化物酶標
記的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體；
4)將空白96孔酶標板1塊、步驟1)得到的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品1支、步驟2)得到
的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體1支、步驟3)得到辣根過氧化物酶標記的兔抗大
瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體1支，以及包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終
止液各1支放入盒內，得到檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的夾心ELISA試劑盒；
所述的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品的制備方法如下：
采用肌肉注射17β-雌二醇(17β-estradiol，E₂)的方式誘導大瀧六線魚產生卵黃原蛋
白；注射一周后取血，4℃，5000 g離心10分鐘，收集上清液；向上清中加入等體積的飽和硫
酸銨溶液，冰浴條件下搖晃2小時后離心，向沉淀中加入pH 7.5、25mM Tris-HCl，使沉淀重
新溶解；進一步的純化采用1.5′ 20 cm的 Sephadex G-200層析柱，加入1 ml上述溶液，用
pH 7.5的25mM Tris-HCl 洗層析柱，收集第一個洗脫峰，即為大瀧六線魚卵黃原蛋白；
所述的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下：
取600 μg純化的大瀧六線魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，對大白兔進行
背部皮下多點注射，兩周后再次加強免疫，免疫劑量為600μg/只，用弗氏不完全佐劑充分乳
化后進行背部皮下注射；此后，每隔10天按以上方法進行加強免疫；于每5次注射5天后從心
臟取血，6000 g離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗血清；
向抗血清中加入等體積的pH 7.4 0.02 mol/L磷酸緩沖液；在冰浴條件下加入硫酸銨，至
50%飽和度，0℃震蕩2h后，低溫離心，8000 g、15min，棄上清，沉淀用10ml 0.02mol/L磷酸緩
沖液溶解；以0.02mol/L磷酸緩沖液透析24h；用0.45微米孔徑的濾膜過濾后，上Hitrap
Protein G柱，隨后以0.02 mol/L磷酸緩沖液洗脫10個柱體積，然后以pH2.7、0.1M甘氨酸洗
脫抗體，即獲得兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體；
所述的辣根過氧化物酶標記兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下：
向3mg/mL的辣根過氧化物酶中加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄溶液，4℃避光攪拌20分鐘；
將溶液裝入透析袋中，用pH4.4、1mM的醋酸鈉緩沖液透析過夜；取出，加入0.16 M乙二醇水
溶液0.5ml，4℃搖晃30min；加入純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，對pH 9.5、
0.05M碳酸鹽緩沖液透析過夜；加入0.1ml新配的5mg/ml的 NaBH₄溶液，混勻，置4℃，2h；緩
慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃，震蕩30min后，5000rpm離心10min，沉淀物溶于少量
pH7.4、0.15M的PBS中，裝入透析袋，在4℃透析過夜；5000r/min離心10min，收集上清液即為
辣根過氧化物酶標記兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。