一種精子頂體反應試劑盒，包括組織片保存液、熒光結合物、熒光封固液。所述組織片保存液每100ml含有戊二醛0.5ml、甲醇5ml、乙醇2ml、聚乙烯吡咯酮PVP0.2g、福爾馬林1ml，余量為純凈水。該試劑盒可進行精子誘發頂體反應檢測，如不進行鈣離子誘發，則可用于精子頂體反應狀況評估、精子頂體完整性測定。組織片保存液可讓整個精子誘發頂體反應檢測試驗過程分成兩部分進行，保存第一部分實驗得到的樣品和試驗結果，在隨后72小時內的任意時間里進行第二部分的操作都不會影響最終的試驗結果，緩解工作強度。熒光染色系統的熒光強、可穩定15天不衰減，檢測結果更加穩定、易判讀，也保證了結果的可重復性。該試劑盒及測定方法可以臨床應用推廣。

1.一種精子頂體反應試劑盒，其特征在于，包括組織片保存液、熒光結合
物、熒光封固液；
所述組織片保存液每100ml含有：戊二醛0.5ml、甲醇5ml、乙醇2ml、
聚乙烯吡咯酮PVP0.2g、福爾馬林1ml，余量為純凈水；
所述熒光結合物由熒光結合物PSA-FITC與熒光結合物保存液組成，
pH7.5～8.0，每100ml熒光結合物保存液中加入1mg熒光結合物PSA-FITC；
其中所述熒光結合物保存液以純凈水溶解如下物質配制而成，每100ml
含有：
熒光素標記物：0.5～10ng，其中，熒光素為異硫氰酸熒光素或四甲基巨
異硫氰酸若丹明；被標記物為豌豆凝集素、花生凝集素或刀豆蛋白A；
摩爾比為1∶2的甲基丙烯酸與甲基丙烯酸甲酯共聚物：0.4～2.4g；
Tris緩沖液：0.7～3.5g；
NaCl：0.3～1.5g；
酪蛋白：0.1～0.5g；
水楊酸鈉：0.2～2.0mg；
防腐劑Proclin300：20～100ul；
余量為純凈水；
所述熒光封固液以純凈水溶解如下物質配制而成，pH8.5-9.0，每100ml
含有：
N-(1，3-二甲基丁基)-N′-苯基對苯二胺：0.05～0.5g；
聚乙烯醇PVA：0.2～1.6g；
聚乙二醇8000：0.1～1.5g；
Tris緩沖液：1.0～5.0g；
NaCl：0.4～1.6g；
小牛血清白蛋白BSA：0.5～5g；
NaN₃或硫柳汞：0.01～0.05g；
甘油：6％～60％；
余量為純凈水。
2.根據權利要求1所述的精子頂體反應試劑盒，其特征在于，所述精子頂
體反應試劑盒還包括鈣離子載體。
3.根據權利要求5所述的精子頂體反應試劑盒，其特征在于，所述鈣離子
載體為鈣離子載體A23187。
4.根據權利要求1所述的精子頂體反應試劑盒，其特征在于，所述精子頂
體反應試劑盒還包括80％密度梯度溶液、40％密度梯度溶液、精子洗滌液A、
精子培養液、5×精子洗液B、對照液、固定液、組織載片、長形蓋玻片。
5.一種利用權利要求1-4任一項所述的試劑盒進行精子誘發頂體反應檢
測的方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟一：將新鮮的精液標本完全液化，再以密度梯度法或上泳法提取活
力精子，然后計數提取后活動精子的密度，以精子培養液配制密度為1×10⁶
活動精子/ml的精子懸液；
步驟二：以容量為1.5ml的潔凈Eppendorf管作為反應管，每例檢測標
本均同時設測定管和對照管，每管加入步驟二中制備得到的精子懸液0.5ml，
在CO₂占體積含量5％、空氣占體積含量95％的二氧化碳培養箱中在37℃下孵
育3小時，以誘導精子獲能；
步驟三：向測定管內避光加入鈣離子載體2.5ul，向對照管中加入對照液
2.5ul，分別混勻；將兩管在CO₂占體積含量5％、空氣占體積含量95％的二氧
化碳培養箱中在37℃下孵育15分鐘；
步驟四：取出反應管，迅速在對照管和測定管中分別加入精子洗液B應
用液1ml；以600g相對離心力離心5min后去除上清液，加入精子洗液B應
用液1.5ml，再次以600g相對離心力離心5min后去除上清液，然后以精子
洗液B應用液調整精子懸液體積至100ul；
步驟五：取步驟四得到的10μl精子懸液均勻涂布于組織載片上的涂片
窗內，空氣中自然干燥；
步驟六：將組織載片完全浸泡于盛有固定液的反應池內，蓋緊蓋后置室
溫固定30min；生理鹽水洗滌3次，每次浸泡2min；
步驟七：去除組織載片表面及涂片窗內的水分，組織載片干燥后在涂片
窗內迅速加入所述熒光結合物40μl，水平放置于濕盒內，37℃反應60min，
以蒸餾水洗滌3次，每次浸泡2min；
步驟八：步驟七得到的組織片自然干燥后，在每個涂片窗內加1滴熒光
封固液，蓋上蓋玻片，在激發光450-490nm、藍色濾光片的熒光顯微鏡100
倍物鏡下觀察結果，其中，每個涂片窗至少觀察計數400個精子，記錄發生
頂體反應的精子數量，并進行結果計算和判定。
6.根據權利要求5所述的精子誘發頂體反應檢測的方法，其特征在于，當
不能一次性連續完成檢測工作，則可在所述步驟五之后、步驟六之前，執行
如下步驟：將干燥后的組織載片完全浸泡于盛有組織片保存液的反應池內，
蓋緊蓋后置于2-8℃保存，在72小時內取出，然后繼續執行所述步驟六～八。
7.一種利用權利要求1-4任一項所述的試劑盒進行精子頂體反應狀況評
估的方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟一：簡單洗滌精子標本或以上泳法提取高活力精子或以密度梯度法
提取高活力精子，然后以生理鹽水將精子密度調節至5×10⁶/ml；
步驟二：取10μl精子懸液均勻涂布于組織載片上的涂片窗內，空氣中
自然干燥；
步驟三：將組織載片完全浸泡于盛有固定液的反應池內，蓋緊蓋后置室
溫固定30min；生理鹽水洗滌3次，每次浸泡2min；
步驟四：去除組織載片表面及涂片窗內的水分，在涂片窗內迅速加入熒
光結合物50μl，水平放置于濕盒內，37℃反應60min；
步驟五：然后以蒸餾水洗滌3次，每次浸泡2min；
步驟六：組織片自然干燥后，每個涂片窗內加1滴熒光封固液，蓋上蓋
玻片，在激發光450-490nm、藍色濾光片的熒光顯微鏡100倍物鏡下觀察結果，
其中，每個涂片窗至少觀察計數400個精子，記錄各類精子頂體狀態的數量：
精子頭部1/2以上部位有明亮均勻的熒光為頂體完整，計為AI；僅在精子頭
部赤道板有一條熒光帶或者所有的頂體區均無熒光為頂體反應，計為AR；其
它精子為異常頂體；計算AI、AR占所觀察精子的百分率。