本發明公開了一種基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒，該試劑盒由具有富集抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠、多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質控品以及PBST緩沖液所組成；質控品包括陽性質控品以及陰性質控品；陽性質控品為人肺炎衣原體感染者的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體分別為陽性的血清；陰性質控品是抗人肺炎衣原體IgM、IgG均為陰性的人血清。本發明具有簡便、快速、高靈敏度的優點，可實現對抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體的同步檢測。

1.一種用于制備基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG
抗體快速共檢試劑盒的方法，所述基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎衣
原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒由具有富集抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體功能
的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠、多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG抗體
納米探針、質控品以及PBST緩沖液所組成；所述質控品包括陽性質控品以及陰性
質控品；所述陽性質控品由兩份人肺炎衣原體感染者的抗人肺炎衣原體IgM抗體
陽性的血清及兩份抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性的血清組成；所述陰性質控品
是四份抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清；其特征在于：所述方法
包括以下步驟：
1)抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠的制備：
1.1)重組M98-His融合蛋白的制備、純化：
1.1.1)對人肺炎衣原體98KD外膜蛋白進行生物信息學分析，獲取人肺炎衣
原體98KD膜蛋白胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的基因序
列；
1.1.2)在步驟1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分別引入酶切位
點并化學合成全基因序列，同時標記記為M98；
1.1.3)將步驟1.1.2)中所得到的M98按分子生物學方法克隆入表達載體
pET-28a(+)后轉入大腸桿菌中表達重組M98-His融合蛋白；所述重組M98-His
融合蛋白以包涵體表達形式存在于基因工程菌體中；
1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組M98-His融合蛋白，SDS-PAGE
檢測其純度后，再對重組M98-His融合蛋白進行復性，經bradford試劑盒進行蛋
白質濃度測定后，用PBS緩沖液調整濃度為0.2mg/mL；所述PBS緩沖液中各成分
含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，所
述PBS緩沖液的pH＝7.4；
1.2)納米磁珠的包被：
1.2.1)取5mg磁珠，用1mlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進
行磁分離后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe₃O₄為內核、粒徑為1150nm的羧
基磁珠；所述MES緩沖液是質量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES
緩沖液的pH＝6.0；所述納米磁分離器的磁性強度是0.4T；
1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的
EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS
溶液各0.5ml，以10-40rpm于旋轉混合儀中活化1hr，置于納米磁分離器中進
行磁分離后移除上清，用1ml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的
磁珠；
1.2.3)取5個離心管，在每個離心管中加入200μL步驟1.2.2)所得到的活
化后的磁珠，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用
PBS緩沖液稀釋的濃度為50-200μg/ml的由步驟1.1.4)所制備的重組M98-His
融合蛋白溶液各1ml，室溫下以15rpm于旋轉混合儀中反應2-6h，置于納米磁
分離器中進行磁分離后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖
液，室溫下以15rpm于旋轉混合儀中反應2h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基；
所述PBS緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，
1.44g/LNa₂HPO₄，所述PBS緩沖液的pH＝7.4；
1.2.4)封閉反應完成后，將該5個離心管置于納米磁分離器中進行磁分離后
移除上清，各用1ml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：
8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.5ml/LTween-20，
所述洗滌緩沖液的pH＝7.4；
1.2.5)向各個離心管中分別加入1ml保存緩沖液重懸磁珠，置于4℃保存
備用；至此制得抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠；所述保存緩沖液中各成分含
量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/L
NaN₃，5g/LBSA，所述保存緩沖液的pH＝7.4；
2)多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針的制備：
其具體制備方法包括：
2.1)向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點、300nmolN-羥
基琥珀酰亞胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為5
ml，混合溶液，37℃反應30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及
EDC，得到活化后的量子點；所述羧基水溶性量子點的發射波長是520nm；所述
磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，
4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩沖液的pH＝7.4；
2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入2-12nmol的鼠抗人IgM
單克隆抗體，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH₂至終濃度為1％，
封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應1h；
2.3)用0.2μmPES濾器過濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然后將濾液
轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4℃下離心15min，除去未發
生偶聯反應的抗體和反應中的副產物；
2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于2
ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉移到一個新的50000MW超濾離心管中，以8000
g離心力在4℃下離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，
溶于1ml磷酸鹽保存液中，置于4℃保存備用，至此制得量子點標記的抗人IgM
納米探針；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L
磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗
滌液的pH＝7.4；所述磷酸鹽保存液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295
g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述
磷酸鹽保存液的pH＝7.4；
2.5)按與步驟2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波
長為600nm的羧基水溶性量子點制得量子點標記的抗人IgG納米探針；將上述兩
種量子點標記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得多色量子點分別標記的
抗人IgM、IgG納米探針；
3)PBST緩沖液的配制：
其具體配制方法包括：
取8gNaCL，0.2gKCl，0.24KH₂PO₄，1.44gNa₂HPO₄，5gBSA，0.3gNaN₃，
0.5mlTween-20溶解于900ml蒸餾水中，用5MNaOH調整pH至7.4，再定容至1000
ml；
4)質控品的制備：
4.1)陽性質控品：
4.1.1)抗人肺炎衣原體IgM抗體陽性質控品：由0.5ml人肺炎衣原體感染者
的已確定抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽性的血清構成；
4.1.2)抗人肺炎衣原體IgG抗體陽性質控品：由0.5ml人肺炎衣原體感染者
的已確定抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽性的血清構成；
4.2)陰性質控品：由0.5ml抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血
清構成。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1.2.2)中，依次加
入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟
1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm
于旋轉混合儀中活化1hr，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，用1ml
步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為150μ
g/ml的由步驟1.1.4)所制備的重組M98-His融合蛋白溶液各1ml，室溫下以15rpm
于旋轉混合儀中反應3h，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清后，各加
入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液；
所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入6nmol的鼠
抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述量子點是羧基化兩親
聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述磁珠是以超順磁性Fe₃O₄
為內核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團為羧基、粒徑為1150nm的羧基磁珠。