本發明涉及一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒及其制備和應用，包括以下物質：（1）致敏原核表達腸道病毒71型VP1特異性抗原的羧化乳膠試劑；（2）致敏三株針對腸道病毒71型VP1的單克隆混合抗體的羧化乳膠試劑；（3）腸道病毒71型陰陽性標準血清，滅活病毒溶液及PBS和（4）含有可供致敏乳膠進行凝集反應的玻片平臺及用于混勻乳膠和待反應血清的牙簽或塑膠棒。本發明可以檢測不同來源樣本中的EV71抗原，克服了蛋白致敏普通乳膠時，致敏抗原量少、不穩定、致敏后的蛋白容易脫落等缺點。本發明的檢測方法可用于腸道病毒71型的血清流行病學調查、臨床輔助診斷以及EV71病毒的復制調控、抗病毒治療藥物篩選等科研領域。

1.一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：（1）制備三種EV71單克隆抗體：用原核表達純化的EV71VP1蛋白免疫BALB/c小鼠，采用常規雜交瘤細胞技術制備若干株雜交瘤細胞，進行細胞培養后收集培養液，然后用免疫印跡方法篩選出三株特異性敏感性均較高的三株，進行層析純化后濃縮并凍干，-80℃保存備用；（2）pET-28a-VP1的構建及蛋白表達純化：把EV71-C4標準株的VP1基因克隆入原核表達載體pET-28a，BL21大腸桿菌中進行原核表達EV71病毒VP1蛋白，Ni柱進行親和純化，-80℃保存備用；（3）羧化乳膠凝集方法的建立：通過碳化二亞胺把純化后的蛋白或者單克隆抗體偶聯到乳膠顆粒上，遵循固定其它條件，改換其中一個條件的原則，摸索偶聯蛋白量，偶聯時間，膠乳濃度，選擇偶聯反應終止劑和封閉劑；所述碳化二亞胺的工作液濃度為1.0-2.3%，碳化二亞胺的反應終濃度為60-80μl，碳化二亞胺的反應時間為2.5-3小時；所述的偶聯蛋白量為20-70ug，偶聯時間為4.5-9.6小時，所述的乳膠濃度為110-180ul；所述的偶聯反應終止劑為20-60μl的0.1M乙醇胺溶液加入1-2mlpH8.0硼酸緩沖液懸浮的乳膠溶液中制得；（4）腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測試劑盒的組裝：將制備好的致敏乳膠、陰陽性對照、載玻片和膠棒組裝成檢測試劑盒；所述腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒由以下物質組成：（1）致敏原核表達腸道病毒71型VP1特異性抗原的羧化乳膠試劑；（2）致敏三株針對腸道病毒71型VP1的單克隆混合抗體的羧化乳膠試劑；（3）腸道病毒71型陰陽性標準血清，滅活病毒溶液及PBS和（4）含有可供致敏乳膠進行凝集反應的玻片平臺及用于混勻乳膠和待反應血清的牙簽或塑膠棒。2.如權利要求1所述腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述步驟（3）中通過碳化二亞胺把純化后的蛋白或者單克隆抗體偶聯到乳膠顆粒上的具體步驟為：（a）取羧化膠乳放入離心管中，用pH9.6的碳酸緩沖液洗3遍后，再用pH4.5的磷酸緩沖液洗3遍；（b）加入水溶性碳化二亞胺在pH4.5的磷酸緩沖液中室溫作用3h；（c）用pH8.0硼酸緩沖液洗3遍；（d）在膠乳懸液中加入VP1蛋白質抗原或混合單抗，搖床上感作6小時后，將膠乳抗體檢測試劑懸浮于貯存液中。3.如權利要求1所述腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述的腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒制備后，對試劑盒的特異性、敏感性、重復性和保存期進行了測定和優化。4.如權利要求1所述腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒在檢測腸道病毒71型抗原和抗體中的應用。