本發(fā)明涉及一種在排除分子間二硫鍵干擾的條件下特異檢測蛋白質(zhì)或多肽半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的方法；涉及執(zhí)行所述方法的試劑盒，涉及所述試劑盒用于篩選新的生理病理相關(guān)的內(nèi)源靶點或者外源半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的蛋白質(zhì)或多肽靶點，用于篩選與設(shè)計可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或多肽半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的藥物，和用于檢測樣品中半胱氨酸巰基相關(guān)修飾含量的用途。

1.一種特異檢測蛋白質(zhì)或多肽半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的方法，包括下
列步驟：
1)使用自由巰基特異性封閉試劑封閉所述蛋白質(zhì)或多肽上的自由巰
基；
2)除掉未結(jié)合的封閉試劑，使用所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的特異性
還原劑將被修飾的半胱氨酸巰基還原為自由巰基，同時加入巰基特異性不
可逆的標(biāo)記試劑將被還原的自由巰基標(biāo)記為帶有標(biāo)簽的巰基；
3)除去未結(jié)合的標(biāo)記試劑后，加入二硫鍵還原試劑，還原蛋白質(zhì)或多
肽分子間的二硫鍵；和
4)親和純化具有帶有所述標(biāo)簽的巰基的蛋白質(zhì)或多肽，使用親和素變
性的方法來洗脫所述蛋白質(zhì)或多肽，并隨后對洗脫的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行蛋
白質(zhì)或多肽印跡或者質(zhì)譜鑒定。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰基亞
硝基化，且在步驟2)的還原過程中加入亞硝基化特異性還原劑。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述亞硝基化特異性還原劑是抗壞血
酸鈉。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰基次
磺酸化，且在步驟2)的還原過程中加入次磺酸化特異性還原劑。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述次磺酸化特異性還原劑是亞砷酸。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰基棕
櫚酰化，且在步驟2)的還原過程中加入棕櫚酰化特異性還原劑。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述棕櫚?；禺愋赃€原劑是羥胺。
8.按照權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述自由巰基特異性封閉
試劑選自甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)、馬來酰亞胺、N-乙基馬來酰亞胺
(NEM)、碘乙酰胺、碘乙酸或丙烯酰胺。
9.按照權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中在步驟2)的標(biāo)記過程中
使用加熱條件加速標(biāo)記反應(yīng)。
10.按照權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述二硫鍵還原試劑選
自二巰基蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇(2-ME)、磷酸三丁酯(TBP)、或磷酸
三(2-氯乙基)酯(TCEP)。
11.按照權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中在步驟3)中，在加熱條
件下使用DTT。
12.按照權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述巰基特異性不可逆
的標(biāo)記試劑包括三個部分：
一個巰基特異的巰基反應(yīng)基團(tuán)；
一個可以被特異識別純化的標(biāo)簽分子；和
一個連接這兩部分的連接體，
其中所述巰基反應(yīng)基團(tuán)選自馬來酰亞胺、N-乙基馬來酰亞胺或碘乙酰
胺中的巰基反應(yīng)基團(tuán)，所述可以被特異識別純化的標(biāo)簽分子選自生物素、
生物胞素、脫硫生物素，或被特異識別純化的小肽段，所述小肽段包括
His₆，所述連接體是一個或多個，選自穩(wěn)定同位素或遇光斷開的連接基團(tuán)。
13.按照權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述巰基特異性不可逆
的標(biāo)記試劑選自生物素馬來酰亞胺、生物素聚乙二醇馬來酰亞胺、3-(馬
來酰亞胺丙酰)-生物胞素、N-碘乙酰-N-生物素己二胺、碘乙酰聚乙二醇
生物素、1-生物素胺-4-(4’-[馬來酰亞胺乙基-環(huán)己烷]-甲酰胺)丁烷、或輕
或重同位素親和標(biāo)簽試劑。
14.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述可以被特異識別純化的標(biāo)簽分
子是生物素，且用親和素檢測生物素。
15.用于特異檢驗蛋白質(zhì)或多肽半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的試劑盒，包括
巰基特異性不可逆的標(biāo)記試劑和二硫鍵還原試劑。
16.按照權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰
基亞硝基化。
17.按照權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰
基次磺酸化。
18.按照權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰
基棕櫚?；?br/>19.按照權(quán)利要求15的試劑盒，還包括自由巰基特異性封閉試劑、所
述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的特異性還原劑、親和純化緩沖液、親和純化介
質(zhì)或變性洗脫劑。
20.按照權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰
基亞硝基化，且所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的特異性還原劑是亞硝基化特
異性還原劑。
21.按照權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述亞硝基化特異性還原劑是抗
壞血酸鈉。
22.按照權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰
基次磺酸化，且所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的特異性還原劑是次磺酸化特
異性還原劑。
23.按照權(quán)利要求22的試劑盒，其中所述次磺酸化特異性還原劑是亞
砷酸。
24.按照權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾是巰
基棕櫚酰化，且所述半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的特異性還原劑是棕櫚?；?br/>異性還原劑。
25.按照權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述棕櫚?；禺愋赃€原劑是羥
胺。
26.按照權(quán)利要求15-25中任一項的試劑盒，其中所述巰基特異性不
可逆的標(biāo)記試劑包括三個部分：
一個巰基特異的巰基反應(yīng)基團(tuán)；
一個可以被特異識別純化的標(biāo)簽分子；和
一個連接這兩部分的連接體，
其中所述巰基反應(yīng)基團(tuán)選自馬來酰亞胺、N-乙基馬來酰亞胺或碘乙酰
胺中的巰基反應(yīng)基團(tuán)，所述可以被特異識別純化的標(biāo)簽分子選自生物素、
生物胞素、脫硫生物素，或被特異識別純化的小肽段，所述小肽段包括
His₆，所述連接體是一個或多個，選自穩(wěn)定同位素或遇光斷開的連接基團(tuán)。
27.按照權(quán)利要求15-25中任一項的試劑盒，其中所述巰基特異性不
可逆的標(biāo)記試劑選自生物素馬來酰亞胺、生物素聚乙二醇馬來酰亞胺、3-
(馬來酰亞胺丙酰)-生物胞素、N-碘乙酰-N-生物素己二胺、碘乙酰聚乙
二醇生物素、1-生物素胺-4-(4’-[馬來酰亞胺乙基-環(huán)己烷]-甲酰胺)丁烷、
或輕或重同位素親和標(biāo)簽試劑。
28.按照權(quán)利要求15-25中任一項的試劑盒，其中所述二硫鍵還原試
劑選自二巰基蘇糖醇、2-巰基乙醇、磷酸三丁酯或磷酸三(2-氯乙基)酯。
29.按照權(quán)利要求19-25中任一項的試劑盒，其中所述自由巰基特異
性封閉試劑選自甲基硫代磺酸甲酯、馬來酰亞胺、N-乙基馬來酰亞胺、碘
乙酰胺、碘乙酸或丙烯酰胺。
30.按照權(quán)利要求15-25中任一項的試劑盒用于篩選新的生理相關(guān)的內(nèi)
源靶點或者外源半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的蛋白質(zhì)或多肽靶點的用途。
31.按照權(quán)利要求15-25中任一項的試劑盒用于篩選和設(shè)計可以調(diào)節(jié)蛋
白質(zhì)或多肽半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的藥物中的用途。
32.按照權(quán)利要求15-25中任一項的試劑盒在檢測樣品中半胱氨酸巰基
相關(guān)修飾含量的用途。
33.按照權(quán)利要求15-25中任一項的試劑盒在利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來研
究或者篩選半胱氨酸巰基相關(guān)修飾的蛋白質(zhì)中的用途。