1.轉基因玉米的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:A、玉米果穗處理與幼胚的分離(1)玉米植株授粉6-15d后,幼胚長至0.5-2.0mm時,收獲玉米幼穗,去除苞葉,準備滅菌;(2)將濃度為6.15%的次氯酸鈉母液用滅菌水按體積比稀釋到15%-20%,每升溶液加入5-10μL Tween-20混勻制成滅菌液;(3)將玉米幼穗放入滅菌液中浸泡15分鐘,無菌水沖洗3-5次,備用;(4)在超凈工作臺中用無菌的手術刀片削去種子頂端,用無菌刮鏟掘取胚乳使幼胚從種子中暴露出來,剝取幼胚,將分離出的幼胚放入含有1.8mL懸浮液的2mL塑料離心管中;B、侵染與共培養(1)吸去離心管中的懸浮液,加入200μL新鮮的懸浮液,4000rpm離心15s,45℃水浴熱擊3min,然后轉入0℃冰浴1min;(2)用移液槍吸去離心管中的懸浮液,加入1.0mlOD600值為0.3攜帶目的基因和Bar標記基因的農桿菌侵染液,菌株為EHA105,侵染5-15min;(3)將離心管中的幼胚懸浮后倒入共培養培養基,并用移液槍吸去表面多余的農桿菌侵染液,將幼胚盾片朝上放置,于23℃黑暗共培養2-4d;C、誘導與篩選(1)共培養后,將幼胚轉移到愈傷誘導培養基中,于26℃-34℃黑暗培養7-14d,誘導初級愈傷組織;(2)初級誘導培養結束后,將初級愈傷組織轉入含草丁膦的篩選培養基上,于28℃黑暗培養;定期觀察愈傷的生長狀況及是否產生污染,若發生污染及時更換新的培養基;篩選2-3輪,一輪為2周;D、植株再生與移栽(1)篩選培養結束后,將表現抗性的愈傷組織轉移至分化培養基I中,25℃,5000lx,光照培養1周;(2)將出現綠點的愈傷組織轉移至分化培養基II中,光照培養2周;(3)將分化出的幼苗轉移至生根培養基上,25℃,5000lx,光照培養直至生根;(4)將轉基因再生苗轉入專用穴盤中生長,煉苗后移栽于溫室中,3-4個月后即可收獲后代種子;上述方法中使用的培養基配方如下:①懸浮液:MS鹽2g/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L,以水配制;②侵染液:MS鹽2g/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L+乙酰丁香酮200μM+OD600值0.3農桿菌液,以水配制;③共培養培養基:MS鹽1.0825g/L+N6鹽1.0g/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+鹽酸硫胺素0.5mg/L+AgNO320μM+L-半胱氨酸200mg/L+2,4-D 1.5mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ 0.005mg/L和KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮200μM+MES 0.5g/L+1000×MS維生素1mL/L+植物凝膠8g/L;④愈傷誘導培養基:MS鹽2.165g/L+N6鹽2g/L+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+MES0.5g/L+1000×MS維生素1mL/L+AgNO320μM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.005mg/L和KT 0.1mg/L+特美汀200mg/L+植物凝膠3g/L;⑤篩選培養基:MS鹽2.165g/L+N6鹽2g/L+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+1000×MS維生素1mL/L+AgNO3 20μM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 1.5mg/L+NAA0.5mg/L+MES 0.5g/L+特美汀200mg/L+草丁膦20mg/L+植物凝膠3g/L;⑥分化培養基I:MS鹽4.3g/L+蔗糖20g/L+1000×LS維生素1mL/L+硫酸銅10μM+MES0.5g/L+6-BA 3.5mg/L+特美汀200mg/L+雙丙氨膦3mg/L+植物凝膠3g/L;⑦分化培養基II:MS鹽4.3g/L+蔗糖20g/L+1000×LS維生素1mL/L+硫酸銅10μM+MES0.5g/L+特美汀200mg/L+雙丙氨膦3mg/L+植物凝膠3g/L;⑧生根培養基:MS鹽4.3g/L+蔗糖20g/L+MES 0.5g/L+IBA 0.2mg/L+植物凝膠3g/L;所述玉米品種為玉米自交系AY63。
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