本發明公開了一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO生成速率的方法，屬于生物熒光標記與細胞生物學領域。所述方法將TPP?TMAE溶解于DMSO中，加入培養基，得到溶液b；將細胞器染料溶解于水中，得到溶液c；將細胞傳代至兩組培養皿中，培養，洗滌；向其中一組培養皿中加入溶液c，培養，洗滌，加入培養基，得到待測樣品1；向另外一組培養皿中加入溶液c，培養，洗滌，加入溶液b，洗滌，加入多聚甲醛溶液，靜置，洗滌，加入PBS溶液，得到待測樣品2；通過對比待測樣品1中細胞自身新陳代謝產生CO導致熒光強度?時間變化率與待測樣品2中失活細胞通入氣體后的熒光強度?氣體體積變化率隨的數值，計算單個細胞細胞器在時間t內自身新陳代謝產生的CO的量。

1.一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO₂生成速率的方法，其特征在于：所述方法具
體步驟如下：
(1)將TPP-TMAE溶解于二甲基亞砜中，得到濃度TPP-TMAE為1×10^-2mol/L的溶液a；向溶
液a中加入高糖DMEM培養基，得到TPP-TMAE濃度為1×10^-5mol/L的溶液b；
(2)將細胞器染料溶解于三蒸水中，得到濃度為1×10^-5mol/L的溶液c；
(3)將細胞傳代至兩組培養皿中，將培養皿置于培養箱中培養至細胞數達5×10⁵±0.05
×10⁵個，移除培養基，洗滌；向其中一組培養皿的每個培養皿中各加入體積為v₁的溶液c，并
將所述培養皿置于培養箱中培養15～30min，移除溶液c，洗滌，加入體積為v₂的高糖DMEM培
養基，得到待測樣品1；向另外一組培養皿的每個培養皿中各加入體積為v₁的溶液c，并將所
述培養皿置于培養箱中培養15～30min，移除溶液c，洗滌，加入體積為v₁的溶液b，5秒后移
除溶液b，洗滌，加入體積為v₂的質量濃度為4％的多聚甲醛溶液，靜置10min，洗滌，加入1mL
pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液，得到含有失活細胞的待測樣品2；
其中，所述培養箱培養環境：溫度為37℃、CO₂的體積分數為5％；一組培養皿為3～5個；
所述洗滌采用pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液，洗滌次數為2～3次；所述v₁:v₂為1:10；
(4)向待測樣品1的每個培養皿中各加入體積為v₁的溶液b，每間隔1h測試一次待測樣品
1中細胞內各細胞器的熒光強度，每個樣品共測試6～10次；并根據測試結果繪制單個細胞
細胞器內熒光強度變化率隨時間t的變化曲線，得到曲線一；
其中，加入溶液b時，需保持待測樣品1位置不變；
待測樣品1中單個細胞細胞器內熒光強度變化率＝(I_i-I₀)/I₀，I₀表示單個細胞細胞器
內的初始熒光強度，I_i表示第i次檢測時單個細胞細胞器內的熒光強度，i為1～5的正整數；
(5)先測試出待測樣品2中細胞內細胞器的初始熒光強度；再分次向待測樣品2中注入
氣體，測試每次注入氣體后待測樣品2中失活細胞內各細胞器的熒光強度；其中，每次每個
待測樣品2中注入氣體的體積為1μL，氣體的注入總量為20μL；根據測試結果繪制待測樣品2
中失活細胞通入氣體后單個細胞器的熒光強度變化率隨通入氣體體積的變化曲線，得到曲
線二；
其中，所述氣體為CO₂與空氣的混合氣體，CO₂與空氣的體積比1:1；
待測樣品2中失活單個細胞細胞器內熒光強度變化率＝(I′_k-I′₀)/I′₀，I′₀表示失活單
個細胞細胞器內的初始熒光強度，I′_k表示第k次通入氣體后失活單個細胞細胞器內的熒光
強度，k為1～20的正整數；
(6)根據步驟(4)、(5)待測樣品1和待測樣品2中細胞內各細胞器熒光強度的測試結果
計算單個細胞內各細胞器新陳代謝過程中CO₂含量，具體為：
當曲線一和曲線二中的熒光強度變化率相同時，分別得到曲線一中對應的時間t和曲
線二中對應的通入氣體的體積v；所述體積v中失活細胞內CO₂氣體的含量即為單個活細胞
細胞器在時間t內自身新陳代謝產生的CO₂的量。
2.根據權利要求1所述的一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO₂生成速率的方法，其
特征在于：步驟(2)所述細胞器染料為線粒體染料、內質網染料、高爾基體染料和溶酶體染
料中的一種；
步驟(3)所述細胞為人子宮頸癌細胞、人乳腺癌細胞和CD1小鼠胚胎成纖維細胞中的一
種。
3.根據權利要求1所述的一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO₂生成速率的方法，其
特征在于：步驟(6)所述失活細胞內CO₂氣體的含量的測試方法如下：
(a)將細胞傳代至一組培養皿中，將培養皿置于培養箱中培養8～20h，洗滌，加入1mL質
量百分含量為4％的多聚甲醛溶液，靜置10min，洗滌，加入1mL PBS溶液，向各培養皿中通入
0～20μL¹³CO₂與空氣的混合氣體，立即用PBS溶液離心洗三次，去除上清液，收集細胞，冷凍
抽真空干燥，得到含有失活細胞的待測樣品3；
其中，所述¹³CO₂與空氣的體積比為1:1；所述PBS溶液為pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液；
所述培養箱培養環境：溫度為37℃、CO₂的體積分數為5％；一組培養皿的個數為21個；
(b)用同位素法測定待測樣品3的失活細胞中¹³C的含量，從而得到通入CO₂后進入失活
細胞內的CO₂氣體的含量。
4.根據權利要求3所述的一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO₂生成速率的方法，其
特征在于：所述離心的轉數為1000rpm，離心時間為10min。
5.根據權利要求1所述的一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO₂生成速率的方法，其
特征在于：所述熒光強度的測試均采用激光共聚焦顯微鏡；所述培養皿為激光共聚焦顯微
鏡專用底部帶玻片培養皿，外徑為20mm。