本發明涉及一種用于檢測肼的比率式熒光探針的制備方法及應用。三氯氧磷溶于二氯甲烷中緩慢滴入N,N?二甲基酰胺中，滴加完畢后，再加入環己酮反應得到化合物1。然后將苯并吲哚與碘乙烷溶于乙腈中加熱回流反應得到化合物2。化合物1與化合物2以甲苯與正丁醇為溶劑，加熱回流得到熒光探針化合物3。化合物3溶于無水N,N?二甲基酰胺中,加入醋酸鈉在氮氣保護條件下反應生成化合物4。將化合物4溶于含有乙酰氯無水二氯甲烷中，加入三乙胺后在氮氣保護下常溫反應4小時生成探針Ben?Cy1。該探針在近紅外區工作，適用于生物樣本中的定性、定量分析，低生物毒性、高選擇性；可應用于分析化學、生命有機分析化學等相關領域。

1.一種檢測肼的比率式熒光探針的制備方法，其特征在于，采用以下步驟進行制備：（1）將三氯氧磷溶于二氯甲烷中混合均勻后，滴入無水N,N-二甲基酰胺和二氯甲烷混合溶液中，滴加完畢后，再加入環己酮反應得到化合物1；（2）將苯并吲哚與碘乙烷溶于乙腈中反應得到化合物2；（3）將步驟（1）制備的化合物1與將步驟（2）制備的化合物2以甲苯與正丁醇混合溶劑為溶劑，加熱回流得到熒光探針化合物3；（4）將步驟（3）制備的化合物3溶于無水N,N-二甲基酰胺中, 加入乙酸鈉在氮氣條件下反應生成化合物4；（5）將步驟（4）生成的化合物4溶于無水二氯甲烷中，加入乙酰氯，在冰浴中滴加三乙胺后在氮氣保護下常溫反應4小時生成檢測肼的比率式熒光探針；步驟（5）生成檢測肼的比率式熒光探針的結構為。2.根據權利要求1所述的檢測肼的比率式熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟具體的操作方法為：（1）將40mL無水N,N-二甲基甲酰胺溶于 40mL二氯甲烷, 倒入夾套瓶中-10℃冷卻并攪拌 20 min得到混合溶液1；將27-47mL三氯氧磷溶于35mL二氯甲烷中，混合均勻后倒入恒壓漏斗中, 緩慢滴加到混合溶液1中不斷攪拌；滴加完畢后，加入 8-12g環己酮，溶液變為亮黃色時恢復到室溫，然后緩慢加熱至40℃，加熱回流3h；回流結束后將反應液快速加入裝有碎冰的燒杯中，冷卻到室溫后用二氯甲烷萃取，旋蒸得化合物1；（2）將30ml-70ml的苯并吲哚和30mL-70mL的碘乙烷加入到500mL的三口燒瓶中，加入200mL乙腈，加熱回流24h；冷卻至室溫后過濾，過濾沉淀物經石油醚洗滌后放置于燒杯中，沉淀物晾干得化合物2；（3）將步驟（1）制備的化合物1與步驟（2）制備的化合物2加入到100 mL甲苯-正丁醇混合溶劑中充分溶解，化合物1的溶解濃度為0.017g/mL , 化合物2的溶解濃度為0.037g/mL，除去反應過程中產生的水，加熱回流 3-5h，停止反應后溶液在旋轉蒸發儀上濃縮旋干；粗產品柱層析色譜進行純化，洗脫劑選擇乙酸乙酯：甲醇＝8:1. (V/V)，得化合物3其中所述的甲苯-正丁醇混合溶劑中甲苯和正丁醇的體積比為3:7；（4）將步驟（3）制備的化合物3溶解于無水N,N-二甲基甲酰胺中, 溶解濃度0.025g/mL,然后加入乙酸鈉, 乙酸鈉溶解濃度0.006 g/mL；將混合物在60℃-90℃下在氮氣保護下過夜反應，然后冷卻至室溫并用二氯甲烷萃取，反復萃取4-5次，用飽和的碘化鉀水溶液洗滌3次后，混合物用無水硫酸鈉干燥，然后過濾，濾液真空干燥后進行柱層析,用體積比為從1:0～14:1的二氯甲烷-甲醇體系洗脫劑梯度洗脫，得化合物4；（5）將步驟（4）制備的化合物4溶于無水二氯甲烷溶液, 溶解濃度0.015g/mL，加入乙酰氯，乙酰氯濃度為0.005g/mL，在氮氣保護下在冰浴中滴加三乙胺，三乙胺濃度為0.001g/mL，所得混合物室溫攪拌4-6小時，反應完成后，將產物真空干燥后進行柱層析，用體積比為從1:0～4:1的乙酸乙酯-甲醇體系洗脫劑梯度洗脫，得到產物即為檢測肼的比率式熒光分子探針。3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述檢測肼的比率式熒光分子探針的效果判斷指標如下：檢測靈敏度：檢測限15.2nmol/L；檢測響應倍率：熒光探針在 825nm處的熒光強度明顯地降低，在662nm處的熒光強度顯著增加；顏色變化：日光燈下表現為由綠色變為紅色；光學機理指標：π電子體系的重排檢測肼的比率式熒光分子探針。4.一種權利要求1或2所述的方法制備得到的檢測肼的比率式熒光分子探針的應用，其特征在于：適用于生物樣本中肼的定性或定量分析；其中所述生物樣本為活細胞、活體和生命有機分析化學中的一種。5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于： 所述檢測肼的比率式熒光分子探針定量分析生物樣本中肼時，適用于檢測水樣中肼的量；定性檢測生物樣本中肼時，適用于在活細胞或活體內肼的檢測。6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：所述檢測水樣中肼含量的方法，步驟包括：1）配制溶液探針儲備液：準確稱取檢測肼的比率式熒光分子探針溶于醋酸鹽緩沖液和DMSO，配制為濃度50μM的探針儲備液；所述醋酸鹽緩沖液的pH為 4.5，濃度為10mM；醋酸鹽緩沖液和DMSO的體積比為1:9；肼儲備液：準確稱取0.00032g肼溶于10mL去離子水中，配制為濃度1000μM的肼儲備液；2）建立水樣-肼標準品的線性方程將步驟1）配制的肼儲備液用蒸餾水稀釋得到梯度濃度為0～100μM的肼標準溶液，然后分別取100μL肼標準溶液與100μL步驟1）配制的探針儲備液和650μL去離子水儲備液混合后，加入50μL濃度為10 mM、 pH 4.5的醋酸鹽緩沖液，充分振蕩，使體系混合均勻，在25℃下放置60min，然后經熒光分光光度計檢測，建立水樣-肼濃度與熒光信號強度的線性方程； 3）熒光檢測待測水樣中肼的含量將1000μL待測樣品加入到石英比色皿后，在熒光檢測儀內進行掃描檢測，收集熒光發射位置的強度數據代入水樣-肼濃度與熒光信號強度的線性方程，計算得待測水樣中肼含量。7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：檢測待測水樣品時，以熒光檢測的方法對待測物進行平行檢測，用肼標準品溶液進行校準，得到熒光檢測的檢測范圍，根據不同樣品所含待測物的濃度范圍來選擇熒光檢測手段進行定量。8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于：熒光檢測范圍為0-100μM。9.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：所述活細胞內肼的檢測方法為：將待測活細胞樣品在培養基中培育18～26h，待測活細胞接種量為2×10⁷～9×10⁷個/mL，加入檢測肼的比率式熒光分子探針，探針濃度為5μM，分別加入0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM的N₂H₄，根據所測得熒光探針的熒光發射，選擇激發發射波長，在共聚焦激光掃描顯微鏡上來獲取細胞的熒光圖像，根據發光情況判斷活細胞中是否能用探針檢測肼，判斷標準為：熒光在 825nm處的熒光強度明顯地降低，而在662nm處的熒光強度顯著增加。10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于：所述的活細胞為肝癌細胞，培養基為DMEM培養基。11. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于：活體內肼的檢測方法為：在醋酸鹽緩沖液和DMSO混合物中給予小鼠腹腔注射25μL，50μM Cy7A和隨后的腹腔注射25μL，500μM N₂H₄，在分別孵育0,0.5,1,1.5,2和2.5小時后拍攝圖像，根據發光情況判斷在活體中是否能用探針檢測肼，判斷標準為：隨著時間的增加，熒光在通道1處的熒光強度明顯地降低，而在通道2處的熒光強度顯著增加；其中所述醋酸鹽緩沖液的pH為 4.5，濃度為10mM；醋酸鹽緩沖液和DMSO混合物中醋酸鹽緩沖液和DMSO的體積比為1:9；所述通道1：760-840 nm，λex=740nm；通道2：600-700 nm，λex= 530nm。