本發明屬于分子生物學技術領域，涉及單核苷酸多態性的分析檢測，具體涉及一種普適的利用缺口-連接酶鏈式反應擴增目標DNA，將DNAzyme序列引入連接產物中，然后利用Lambda外切酶降解沒有參與連接反應的磷酸化探針，及外切酶III釋放DNAzyme的檢測方法。本發明將DNAzyme探針與Gap-LCR探針相結合，通過在LCR體系中的待連接的一個磷酸化探針中加入一段DNAzyme序列，Gap-LCR擴增反應結束以后，向體系中加入Anti-G序列（與探針中的DNAzyme序列部分互補配對），利用Lambda外切酶降解5端磷酸化的DNA探針，然后利用外切酶III釋放連接產物中的DNAzyme，通過DNAzyme的特性來進行SNP的定性和定量檢測。本發明具有簡單、方便、實用、經濟，廣泛適用于各種單核苷酸多態性檢測。

1.一種檢測單核苷酸多態性的方法，其特征是：在連接酶鏈式反應Ligase?Chain?Reaction或
者缺口-連接酶鏈式反應Gap-LCR體系中加入兩組探針，其中一個5’-端磷酸化探針的3’-
端用DNAzyme標記，在進行目標核酸的鏈式連接酶擴增反應過程中，依次在DNA聚合
酶和DNA連接酶的作用下將DNAzyme引入到擴增產物中，LCR擴增以后，向擴增的產
物中引入能與DNAzyme的序列部分互補的阻斷序列Anti-G，同時加入終濃度為100mM
的NaCl以促進Anti-G和DNAzyme更好的形成雙鏈結構，然后利用Lambda外切酶選擇
性切割雙鏈DNA中的5’-端磷酸化的DNA探針，而對連接產物不起作用，此時體系中主
要存在著沒有磷酸化的探針和連接產物，接著利用外切酶III降解雙鏈DNA的3’-端為平
末端或者凹陷末端的序列，從DNA鏈的3’-端釋放單磷酸核苷酸，產生單鏈DNA片段，
將連接產物中的DNAzyme標記釋放，通過檢測LCR消化產物中釋放出的DNAzyme標記
物來進行單核苷酸多態性的定性或定量分析；寡核苷酸探針中含有一段15個堿基以上的
序列能與目標核酸序列互補，阻斷序列Anti-G與DNAzyme序列有12個堿基的序列完全
互補配對，使DNAzyme序列處于封閉狀態，以保證Lambda外切酶能夠徹底消化LCR擴
增反應以后體系中剩余的含DNAzyme序列的磷酸化探針，從而降低檢測背景；本方法不
以疾病診斷和治療為目的。
2.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述寡核苷酸探針中的
DNAzyme標記是一種能夠產生信號的、具有過氧化物酶催化功能的DNA序列。
3.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述核酸聚合酶是一種不
具有5’-3’和3’-5’外切酶活性的耐熱性核酸聚合酶。
4.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述核酸連接酶是一種具
有耐熱性的核酸連接酶。
5.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述的Lambda外切酶是
一種5’-3’外切脫氧核糖核酸酶，能選擇性切割雙鏈DNA中的5’-端磷酸化的DNA序列，
對單鏈DNA和未磷酸化DNA的活性較低、對含有切口的DNA無活性、對缺口的DNA
活性有限。
6.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述的外切酶III是一種
具有3’-5’的脫氧核糖核酸酶活性的外切酶，降解雙鏈DNA的平末端，5’-突出末端或切口，
從DNA鏈的3’-端釋放5’-單磷酸核苷酸，產生單鏈DNA片段；該酶對具有至少有4個堿
基且末端不是C殘基的3’-突出末端的DNA、單鏈DNA、硫代磷酸酯連接的核苷酸無活
性。
7.根據權利要求1所述的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是：所述寡核苷酸探針有20-25
個核苷酸與目標核酸序列互補配對，DNAzyme序列不包含在此片段中。